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在木质纤维素的降解研究中发现了一种与传统的纤维素酶具有协同作用的酶,其通过催化糖苷键氧化裂解的方式,破坏纤维素顽固的晶体结构,在增强纤维素酶的降解效率以及生物质酶转化等方面均发挥了重要作用。该酶被划分为裂解多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO),近年来受到研究者的广泛关注。本实验室前期已将来自红侧耳(Pleurotus djamor)的裂解多糖单加氧酶基因PdLPMO9A在毕赤酵母中成功实现表达,但其表达量较低,给后期的分离纯化带来极大困难。由此,本研究通过基因全序列密码子优化、增加基因剂量以及联合共表达分子伴侣蛋白等高表达策略,筛选获得了高产重组菌株,为重组裂解多糖单加氧酶PdLPMO9A的规模化生产奠定了理论及方法学基础。主要研究内容和结果如下:1、将PdLPMO9A基因添加组氨酸标签(His-tag),并构建毕赤酵母基因工程菌GS115-9A-H,探究组氨酸标签是否对重组酶活性产生影响。结果表明:对GS115-9A-H菌株进行摇瓶培养和诱导表达,发现His-tag对重组酶的表达及活性无明显影响。此外,发现重组酶可与纤维素酶协同降解稻秆,在72 h时对稻秆的糖化作用比纤维素酶单独水解时提升了89.8%。2、对含有His-tag的PdLPMO9A-H基因进行密码子优化,并构建毕赤酵母基因工程菌GS115-9A-M-H,探究密码子优化策略对重组酶表达的影响。结果表明:对密码优化菌株GS115-9A-M-H进行摇瓶培养,对重组酶进行诱导表达,发酵上清液蛋白含量为0.78 g/L,重组酶活力为13.51 U/L,分别比原菌株GS115-9A提高了11.42%和27.21%。3、对密码子优化基因进行多拷贝表达载体构建,并将其转化至毕赤酵母GS115中,获得含有2拷贝密码子优化基因的菌株GS115-9A-M-H-2,探究此组合策略对重组酶在毕赤酵母中表达的影响。结果表明:对2拷贝菌株GS115-9A-M-H-2进行摇瓶培养,对重组酶进行诱导表达,发酵上清液蛋白含量为0.93 g/L,重组酶活力为14.94 U/L,分别比GS115-9A-M-H菌株提高了20.78%和10.58%。比原菌株GS115-9A菌株提高了36.76%和40.41%。4、构建毕赤酵母辅助蛋白表达载体,将其与PdLPMO9A的密码优化基因在毕赤酵母中共表达,获得基因工程菌GS115-9A-M-H-P,探究此组合策略对重组酶在毕赤酵母中表达的影响。结果表明:对共表达辅助蛋白PDI的密码优化基因工程菌GS115-9A-M-H-P进行摇瓶培养,对重组酶进行诱导表达,发酵上清液蛋白含量为1.19g/L,重组酶活力为17.76 U/L,分别比GS115-9A-M-H菌株提高了52.56%和31.46%。比原菌株GS115-9A菌株提高了75%和66.92%。
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