摘要：【目的】了解鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)在广东部分地区的流行及遗传变异情况,阐明其遗传进化与全基因组的特征,为GAstV的防控提供理论基础。【方法】使用GAstV特异性引物对2021―2022年广东地区养鹅场内出现疑似痛风的36份鹅病料进行PCR检测,选取4份具有代表性的GAstV强阳性样品,利用鹅细小病毒、坦布苏病毒、禽流感病毒、新城疫病毒的特异性引物进行检测,以排除病料中存在其他常见的外源性病毒;在此基础上利用鹅胚及鸡肝癌细胞系(leghorn male hepatoma,LMH)对4份GAstV样品进行病毒的分离和纯化,使用透射电镜对病毒粒子的形态进行观察;设计7对特异性引物对4株GAstV进行全基因组扩增和测序,运用DNAStar软件对序列进行整理与拼接以获取GAstV的全基因组序列,利用MegAlign软件进行核苷酸相似性比对,并对关键氨基酸位点的变异情况进行分析,应用Mega-X软件对全基因及单个ORF基因(ORF1a、ORF1b、ORF2)进行系统进化树构建。【结果】经PCR鉴定发现被检样品中共有30份是GAstV阳性,选取的4份代表性GAstV阳性样品均不存在其他外源性病毒感染,利用鹅胚及LMH细胞成功分离出了该4株GAstV病毒,并获得了4株全长均为7 131 bp的GAstV基因组序列,包括18 bp的5′-UTR和184 bp的3′-UTR、3个阅读开放框(ORF1a、ORF1b和ORF2基因),其中ORF1a、ORF1b和ORF2基因分别长3 255、1 551和2 115 bp,与报道的GAstV全基因组特征基本一致。相似性分析显示,4株GAstV之间的核苷酸相似性在99.4%～99.8%之间,与GenBank收录的其他19株GAstV的核苷酸相似在57.6%～99.6%之间。全基因组及3个ORF基因的遗传进化分析显示,获得的4株GAstV均属于GAstV-Ⅱ型。氨基酸序列分析显示,4株GAstV的氨基酸存在22处位置上的突变,其中ORF1a基因有8处突变,ORF2基因有14处突变。【结论】分离的4株GAstV均为GAstV-Ⅱ型毒株,与中国其他地区流行的基因型基本一致,该4株病毒的氨基酸突变主要发生在ORF1a和ORF2区域,为后续疫苗研发、流行病学调查及致病机理等方面提供参考依据。
文章目录
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料
1.1.2 鹅胚及细胞
1.1.3 主要试剂与仪器
1.2 方法
1.2.1 病料处理
1.2.2 病毒RNA的提取及反转录
1.2.3 病毒的鉴定
1.2.4 病毒分离及电镜观察
1.2.5 GAstV全基因引物设计及合成
1.2.6 GAstV全基因组扩增
1.2.7 GAstV全基因组遗传进化分析
2 结 果
2.1 病毒PCR鉴定结果
2.2 病毒的分离鉴定
2.3 GAstV全基因组测序结果
2.4 GAstV全基因组相似性比对
2.5 GAstV的遗传进化分析
2.6 GAstV氨基酸突变分析
3 讨 论
4 结 论
