摘要：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是香榧(Torreya grandis ‘Merrillii’)根腐病的主要病原菌，本研究分别基于尖孢镰刀菌的的脂肪酸ω-羟化酶CYP505基因序列、立枯丝核菌rDNA-ITS基因序列、齐整小核菌内聚半乳糖醛酸酶EndoPG 1 前体基因序列设计引物和TaqMan探针序列，通过预实验优化扩增反应中探针和引物的反应浓度建立三种病原真菌的多重实时荧光定量PCR，同时分析该检测体系的特异性和灵敏度，绘制标准曲线，评估该检测体系的扩增效率和稳定性。此外，还检测了接种病原菌的一年生榧树苗和野外多年生健康香榧、患病香榧根际土壤和根系内病原真菌DNA的拷贝数。结果表明本实验建立的病原真菌多重实时荧光定量PCR扩增效率均可达到92.5%以上，特异性和重复性良好，检测的浓度范围在1.5×103～1.5×109 copies/g质粒DNA，灵敏度要比普通PCR高100倍，且标准曲线均具有良好的线性，R2均大于0.99，且可快速且有效的检测土壤中的目的病原真菌的基因拷贝数。因此本实验所建立的病原真菌多重实时荧光定量PCR可为香榧根腐病的早期快速诊断、监测等研究提供有效的检测手段。
文章目录
1结果与分析
1.1引物探针
1.2反应体系及反应条件优化
1.3引物及探针的特异性验证
1.4病原真菌多重实时荧光定量PCR的建立
1.5多重实时荧光定量PCR检测方法稳定性评价
1.6榧树根际三种病原菌数量的动态检测
1.7田间香榧根际病原菌数量检测
2讨论
3材料与方法
3.1菌株基因组DNA提取
3.2病原真菌特异性引物/探针组合的设计
3.3反应体系及反应条件优化
3.4引物及探针的特异性验证
3.5标准质粒DNA的构建
3.6病原真菌多重实时荧光定量PCR的建立
3.7多重实时荧光定量PCR检测方法稳定性及灵敏度评价
3.8 香榧根际及根内三种病原菌数量的检测
3.9田间香榧病原菌检测
