摘要：目的 克隆林氏扇头蜱Boophilin-H2基因，构建重组表达载体，在大肠杆菌中表达Boophilin-H2重组蛋白，并检测其抗凝活性。方法 通过设计特异性引物，以林氏扇头蜱饱血成蜱RNA反转为cDNA为模板，PCR扩增Boophilin-H2基因片段，克隆、连接到质粒pSmart-I，构建重组表达载体pSmart-I/Boophilin-H2，BamHI和XhoI双酶切验证重组表达载体，将表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3)感受态中，经IPTG低温诱导表达，Ni-NTAResin纯化重组蛋白，12.5%SDS-PAGE检测重组蛋白表达及纯化情况，使用3.8%枸橼酸钠采血管收集新西兰大白兔股静脉血，离心分离吸取上层血浆，利用体外凝血四项检测盘检测重组蛋白抗凝活性。结果 扩增并克隆出林氏扇头蜱Boophilin-H2基因片段387bp，构建出原核表达载体pSmart-I/Boophilin-H2，双酶切验证载体构建成功，转入大肠杆菌中经0.8mmol/LIPTG诱导表达16h，SDS-PAGE检测表明重组蛋白表达在上清液中，主要以可溶形式存在，编码的Boophilin-H2重组蛋白大小在35kDa左右，纯化Boophilin-H2重组蛋白进行抗凝活性检测表明，重组蛋白能显著延长APTT凝血时长，并具有浓度依赖性，重组蛋白对TT、PT、FIB凝血时长的影响并不显著。结论 本研究构建Boophilin-H2表达载体，其表达产物具有很强的APTT抗凝活性，揭示了重组蛋白发挥作用在内源凝血途径，可能作用于内源性凝血因子Ⅷ、Ⅺ、Ⅻ从而阻止血液凝固，为进一步蜱类防控疫苗和抗凝血药物的研发提供了参考依据和理论基础。
文章目录
1 材料与方法
1.1 林氏扇头蜱人工培育
1.2 主要试剂
1.3 总RNA的提取以及第一链cDNA的合成
1.4 引物的设计与合成
1.5 重组表达载体的构建与鉴定
1.6 重组蛋白的诱导表达与纯化
1.7 抗凝活性测定
2 结果
2.1 Boophilin-H2基因片段的克隆
2.2 原核表达载体的构建与鉴定
2.3 重组蛋白的表达与纯化
2.4 重组蛋白抗凝活性测定
3 讨论
