摘要：群体感应（QS）是细菌通过N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）等信号分子相互交流的过程。通过群体感应淬灭（QQ）酶体外降解AHLs，是抑制腐败菌致腐因子产生的一种有效手段。为进一步提升QQ酶PF-1240的活性和实用性，通过同源建模手段构建酶PF-1240的三维预测模型，并将其与不同的AHLs进行分子对接。以此为基础，利用虚拟突变手段对影响酶活性的关键位点进行筛选并鉴定出Asn418为最佳突变位点，进而对突变体进行表达，分析其酶学性质和QS抑制效果。结果表明：突变酶对短链AHLs有较强的淬灭能力，其最适pH值变为7，最适温度由30 ℃变为20 ℃。此外，突变酶有效降低了蜂房哈夫尼亚菌的群集和泳动能力，当其质量浓度为15 μg/mL时，生物膜的抑制率为41.93%，抑制效果远好于野生酶。本研究表明Asn418是影响PF-1240酶学性质及酶活性的关键氨基酸，为酶PF-1240的理性设计及在水产品保鲜领域应用提供了理论依据。
文章目录
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.2 仪器与设备
1.3 试验方法
1.3.1 同源建模及模型评价
1.3.2 分子对接及突变位点的选择
1.3.3 单点虚拟饱和突变
1.3.4 Asn418Trp突变酶的构建及表达
1.3.4.1 突变质粒转化表达宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)
1.3.4.2 重组蛋白的诱导表达
1.3.4.3 SDS-PAGE蛋白电泳
1.3.4.4 Ni-NTA琼脂糖树脂纯化
1.3.5 PF-1240突变酶的酶学性质测定
1.3.6 PF-1240突变酶对QS的抑制作用
1.3.6.1 PF-1240对蜂房哈夫尼亚菌生物膜的影响
1.3.6.2 蛋白酶及运动性的测定
2 结果与分析
2.1 序列比对及同源建模
2.2 模型评价
2.3 PF-1240与AHLs的分子对接
2.4 PF-1240虚拟突变
2.5 PF-1240N418W的表达及其酶学性质分析
2.6 PF-1240N418W对蜂房哈夫尼亚菌QS的抑制效果
3 结论
