摘要：目的 运用网络药理学与分子对接方法探讨高山金莲花素（alpinumisoflavone,AIF）对颞下颌关节骨关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis,TMJOA）细胞模型的作用机制，为AIF治疗TMJOA提供研究基础。方法 运用GeneCards、OMIM、DisGeNET和PharmGKB数据库获取TMJOA疾病靶点，PharmMapper和HERB获取AIF作用靶点，取化合物与疾病交集靶点上传至STRING数据库得到关键靶点后做GO和KEGG富集分析，分子对接评估相关信号通路中关键靶点。获得医院伦理委员会的审批，提取3周龄SD大鼠髁突软骨细胞。CCK8检测AIF对髁突软骨细胞的毒性。用10 ng/mL白细胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)诱导髁突软骨细胞24 h构建TMJOA细胞模型。实验分为3组，其中，对照组：DMEM培养基培养髁突软骨细胞48 h;IL-1β组（TMJOA细胞模型）：预使用DMEM培养基培养髁突软骨细胞24 h后，保留原培养基的情况下加入IL-1β使终浓度达10 ng/mL继续培养24 h;IL-1β+10μmol/L AIF组：预使用含10μmol/L AIF的DMEM培养基培养髁突软骨细胞24 h，保留原培养基情况下加入IL-1β使终浓度达10 ng/mL继续培养24 h，流式细胞术检测AIF对TMJOA细胞模型中的髁突软骨细胞凋亡的影响。进一步，实验分为对照组、IL-1β组、IL-1β+10μmol/L AIF组和IL-1β+30μmol/L AIF组共4组，其中，IL-1β+30μmol/L AIF组：预使用含30μmol/L AIF的DMEM培养基培养24 h，保留原培养基情况下加入IL-1β使终浓度达10 ng/mL继续培养24 h；其余3组方法同前。以qPCR与Western blot分别检测AIF对TMJOA细胞模型中与细胞凋亡相关的B淋巴细胞瘤2(B-cell leukemia/lymphoma-2,Bcl2)、天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific protease 3,Caspase-3)及基质降解相关的解聚蛋白样金属蛋白酶4(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4,ADAMTS4)、基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP3)和基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)mRNA和蛋白的表达。结果 PharmMapper与HERB数据库检索得到AIF化合物靶点300个，GeneCards、OMIM、DisGeNET和PharmGKB数据库检索得到TMJOA疾病靶点378个，将化合物与疾病靶点交集得33个潜在靶点，将其上传至STRING数据库得31个关键靶点，主要与细胞凋亡和细胞外基质降解相关。这一过程可能涉及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、雌激素及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）等信号通路。分子对接结果表明AIF与MAPK和雌激素信号通路中的关键靶点细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)和雌激素受体基因1/2(estrogen receptor gene 1/2,ESR1/2)具有较好的结合活性。CCK8结果表明AIF对髁突软骨细胞无明显细胞毒性。与IL-1β组相比，IL-1β+10μmol/L AIF组中AIF可抑制髁突软骨细胞凋亡；与IL-1β组相比，IL-1β+10μmol/L AIF组和IL-1β+30μmol/L AIF组中AIF可上调Bcl2和下调Caspase-3 mRNA和蛋白表达，抑制ADAMTS4、MMP3和MMP13 mRNA和蛋白表达。结论 AIF可通过上调Bcl2与下调Caspase-3 mRNA和蛋白表达抑制TMJOA细胞模型中髁突软骨细胞凋亡，同时抑制由IL-1β诱导的细胞外基质降解，延缓TMJOA进展。
