摘要：JIB-04（Jumonji histone demethylase inihibitor，JIB-04）是一种泛组蛋白赖氨酸去甲基化酶抑制剂，可抑制多种肿瘤发生发展，但其具体机制仍不清楚。本文以肝癌细胞HepG2和Huh7为研究对象，探讨了JIB-04对肝癌细胞的增殖影响，并揭示其可能的分子机制。CCK-8和EDU检测细胞增殖实验显示，JIB-04明显抑制肝癌细胞HepG2和Huh7活力，且具有浓度依赖性，其半数抑制浓度分别为0.7689 μmol/L及0.7392 μmol/L。流式细胞术检测细胞内ROS水平变化，结果显示，JIB-04可显著激活细胞内ROS的累积。通过谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒和脂质过氧化物检测试剂盒分别检测细胞内GSH和脂质过氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平发现，在2 μmol/L JIB-04处理下，HepG2和Huh7细胞内GSH分别下降88.4%和80.7%，而脂质过氧化物分别升高4.75倍和9.25倍。通过qRT-PCR和Western印迹分析发现，JIB-04显著降低铁死亡相关因子GPX4和SLC7A11的mRNA水平和蛋白质水平，同时铁死亡相关通路蛋白质MDM2明显下调，P53蛋白水平明显上调。机制研究显示，JIB-04可以使赖氨酸特异性去甲基化酶KDM4C的蛋白质水平下调约58%和51%。通过ChIP检测发现，在JIB-04处理肝癌细胞后MDM2基因启动子区域H3K9me3分别提高了2.19倍和2.14倍，同时qRT-PCR证明，JIB-04处理肝癌细胞后MDM2 mRNA水平显著下调。综上所述，本研究初步揭示了JIB-04可下调特异性去甲基化酶KDM4C的表达，进而影响MDM2基因启动子区域H3K9me3甲基化水平抑制MDM2基因表达，减少MDM2蛋白与P53蛋白结合，P53蛋白水平表达上调，同时，铁死亡相关蛋白质SLC7A11和GPX4的表达下调，导致细胞内GSH耗竭、ROS与脂质过氧化物积累，最终导致细胞发生铁死亡。
文章目录
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 细胞培养
1.3 细胞活力和增殖测定
1.4 细胞内活性氧检测
1.5 细胞内谷胱甘肽和丙二醛检测
1.6 mRNA提取、cDNA合成和实时荧光定量PCR
1.7 蛋白质免疫印迹分析
1.8 染色质免疫沉淀
1.9 统计学分析
2 结果
2.1 JIB-04抑制肝细胞癌生长
2.2 JIB-04诱导肝癌细胞内活性氧水平增加
2.3 JIB-04可降低肝癌细胞内谷胱甘肽水平并提高胞内脂质过氧化产物丙二醛水平
2.4 JIB-04对肝癌细胞内铁死亡相关因子mRNA和蛋白质水平的影响
2.5 JIB-04抑制组蛋白赖氨酸去甲基化酶4表达调控H3K9me3抑制肝细胞癌内MDM2基因表达
3 讨论
