摘要：目的 探讨高迁移率族蛋白B1 (high mobility group box protein B1,HMGB1)-Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)/TLR4-核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)通路在微小隐孢子虫感染致肠黏膜损伤中的作用,以及氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)对小鼠微小隐孢子虫感染的干预作用。方法 4周龄SPF级BALB/c小鼠40只随机分成4组,分别为对照组、感染组、甘草酸(glycyrrhizin,GA)组及OMT组。感染组、GA组及OMT组小鼠给予地塞米松免疫抑制1周后,每只灌胃1×105个微小隐孢子虫卵囊建立微小隐孢子虫肠道感染小鼠模型。模型建立成功后,GA组小鼠连续2周腹腔注射GA 25.9 mL/(kg·d),OMT组连续2周经口灌胃OMT 50 mg/(kg·d);对照组正常饮食、饮水。治疗2周后剖杀各组小鼠,取空肠近端组织。采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察小鼠肠黏膜病理变化,测量肠绒毛高度、肠隐窝深度及两者比值;采用免疫组织化学染色检测小鼠肠上皮细胞中闭合蛋白(occludin)和紧密粘连蛋白1(zonula occludens protein 1,ZO1)表达水平,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测小鼠空肠组织中HMGB1、TLR2、TLR4、髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88)、NF-κB p65 mRNA相对表达量。结果 HE染色结果显示,与对照组比较,感染组小鼠肠绒毛明显萎缩变短、脱落,黏膜下层水肿;GA组和OMT组小鼠肠绒毛结构趋于完整,排列趋于整齐。各组小鼠肠绒毛高度(F=6.207,P=0.000 5)、肠隐窝深度(F=6.903,P=0.000 3)及两者比值(F=37.190,P<0.000 1)差异均有统计学意义。感染组小鼠肠绒毛高度[(321.9±41.1)μm]显著低于对照组[(399.5±30.9)μm](t=4.178,P <0.01)和GA组[(383.7±42.7)μm](t=3.130,P <0.01),感染组小鼠肠隐窝深度[(185.0±35.9)μm]显著高于对照组[(128.4±23.6)μm](t=3.877,P<0.01)及GA组[(143.3±24.7)μm](t=2.710,P<0.05)。OMT组小鼠肠绒毛高度[(375.3±22.9)μm]显著高于感染组(t=3.888,P <0.01),与对照组差异无统计学意义(t=1.989,P>0.05);OMT组小鼠肠隐窝深度[(121.5±27.3)μm]显著低于感染组[(185.0±35.9)μm](t=4.133,P<0.01),与对照组差异无统计学意义(t=0.575,P> 0.05)。感染组小鼠肠绒毛高度与肠隐窝深度比值[(1.8±0.2)]显著低于对照组[(3.1±0.3)](t=10.540,P<0.01)及GA组[(2.7±0.3)](t=7.370,P<0.01);OMT组小鼠肠绒毛高度与肠隐窝深度比值[(3.1±0.2)]显著高于感染组(t=15.020,P <0.01),与对照组差异无统计学意义(t=0.404,P> 0.05)。免疫组织化学染色结果显示,各组小鼠肠上皮细胞中occludin(F=28.031,P<0.000 1)及ZO1表达水平差异均有统计学意义(F=14.122,P<0.000 1)。感染组小鼠肠上皮细胞中occludin阳性表达率[(14.3±4.5)%]低于对照组[(28.3±0.5)%](t=3.810,P<0.01),GA组[(30.3±1.3)%]、OMT组小鼠肠上皮细胞中occludin阳性表达率[(25.8±1.5)%]显著高于感染组(t=7.620、5.391,P均<0.01),但GA组、OMT组小鼠肠上皮细胞中occludin阳性表达率与对照组差异均无统计学意义(t=1.791、2.033,P均>0.05)。感染组小鼠肠上皮细胞中ZO1阳性表达率[(14.4±1.8)%]显著低于对照组[(24.2±2.8)%](t=4.485,P<0.01),GA组[(24.1±2.3)%](t=5.159,P<0.01)、OMT组小鼠肠上皮细胞中ZO1阳性表达率[(22.5±1.9)%]显著高于感染组(t=4.441,P <0.05),但GA组、OMT组小鼠肠上皮细胞中ZO1阳性表达率与对照组差异均无统计学意义(t=0.037、0.742,P均> 0.05)。qPCR检测结果显示,各组小鼠空肠组织中HMGB1(F=21.980,P <0.000 1)、TLR2(F=20.630,P <0.000 1)、TLR4(F=17.000,P=0.000 6)、MyD88(F=8.907,P=0.000 5)、NF-κB p65 mRNA表达水平差异均有统计学意义(F=8.889,P=0.000 7)。感染组小鼠空肠组织中HMGB1[(5.97±1.07)vs.(1.05±0.07);t=6.482,P<0.05]、TLR2 [(5.92±1.29)vs.(1.10±0.14);t=5.272,P <0.05]、TLR4[(5.96±1.50)vs.(1.02±0.03);t=4.644,P <0.05]、MyD88[(3.00±1.26)vs.(1.02±0.05);t=2.734,P <0.05]、NF-κB p65 mRNA相对表达量[(2.33±0.72)vs.(1.04±0.06);t=2.665,P <0.05]均显著高于对照组。与对照组比较,GA组小鼠空肠组织中HMGB1(0.63±0.01)、TLR2(0.42±0.10)、TLR4(0.35±0.07)、MyD88(0.70±0.11)、NF-κB p65 mRNA相对表达量(0.75±0.01)均显著下降(t=8.629、5.830、11.500、4.729、6.898,P均<0.05)。与感染组比较,GA组小鼠空肠组织中HMGB1、TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相对表达量均显著降低(t=7.052、6.035、4.084、3.165、3.274,P均<0.05);OMT组小鼠空肠组织中HMGB1(1.14±0.60)、TLR2(1.00±0.24)、TLR4(1.14±0.07)、MyD88(0.96±0.25)、NF-κB p65 mRNA相对表达量(1.12±0.17)亦显著低于感染组(t=7.059、5.320、3.510、3.466、3.273,P均<0.05)。OMT组与对照组小鼠空肠组织中HMGB1、TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相对表达量差异均无统计学意义(t=0.239、0.518、1.887、0.427、0.641,P均> 0.05)。结论 微小隐孢子虫感染小鼠后通过上调HMGB1-TLR2/TLR4-NF-KB通路表达引起肠道炎症反应、破坏肠黏膜屏障。OMT可能通过抑制HMGB1-TLR2/TLR4-NF-KB通路活性抑制小鼠肠道炎症,并修复肠黏膜屏障。
