健脾清化方改善局灶节段性肾小球硬化的效应机制研究

　　摘要：目的：探讨健脾清化方对局灶节段性肾小球硬化（FSGS）小鼠及阿霉素（ADR）诱导足细胞损伤的保护作用，并观察其对炎症反应、氧化应激及细胞凋亡的影响。方法：(1)体内实验：实验组balb/c小鼠，采用单次尾静脉注射阿霉素（10.5 mg/kg）的方法建立FSGS动物模型，造模后连续灌胃给药6周。测定24 h尿蛋白（定量）、血肌酐，及肾组织内超氧化物歧酶、丙二醛、过氧化氢酶的水平。并采用H&E、Masson、PAS染色，观察肾组织病理损伤程度。透射电镜观察肾脏超微结构。免疫荧光nephrine/p-JAK2双染观察足细胞上p-JAK2的表达。免疫印迹法检测（western blotting，WB）肾组织中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1蛋白表达水平。(2)体外实验：实验1：采用CCK-8法检测阿霉素及健脾清化方对细胞活力的影响，并筛选出造模和健脾清化方干预浓度。DCFH-DA荧光探针检测各组足细胞ROS的含量。流式细胞术测定足细胞凋亡情况。WB检测p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1的蛋白表达水平以及RT-qPCR检测STAT3下游凋亡因子BAX、BAD、Caspase3、p21、Blc-2、和炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达情况。实验2：WB检测JAK2激动剂C-A1对p-JAK2/JAK2，p-STAT3/STAT3蛋白表达的影响。结果：（1）体内实验：与对照组相比，模型组小鼠肾小球硬化，足细胞足突广泛融合，肾组织p-JAK2荧光表达明显增加。24 h尿蛋白定量、血肌酐、MDA升高，SOD、CAT降低（P<0.05）。p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1表达升高。与模型组相比健脾清化方干预后足细胞损伤缓解，肾组织P-JAK2荧光表达降低，24 h尿蛋白定量、血肌酐、MDA降低，SOD、CAT升高。p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1表达降低（P<0.05）。（2）体外实验：实验1：CCK-8法确定阿霉素造模浓度为0.4 μg/mL，健脾清化方干预低中高浓度分别为1 mg/mL，2 mg/mL，4 mg/mL。与对照组比较，模型组凋亡细胞数量、ROS含量增多，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1蛋白表达升高（P<0.05），BAX、BAD、Caspase3、p21、IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表达降低，Blc-2mRNA表达升高（P<0.05）；与模型组比较，健脾清化方干预后，凋亡细胞数量、ROS含量减少，JAK2/STAT3、TGF-β1蛋白表达降低，BAX、BAD、Caspase3、p21、IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表达升高，Blc-2的mRNA表达降低，且成量效关系（P<0.05）。实验2：与对照组相比，C-A1组p-JAK2/JAK2蛋白表达升高（P<0.05）；与ADR+H组相比，ADR+H+C-A1组p-STAT3/STAT3蛋白表达升高（P<0.05）。结论：健脾清化方可通过抑制JAK2/STAT3信号通路，调节炎症反应、细胞凋亡、氧化应激从而延缓FSGS足细胞损伤的进展。

　　文章目录

　　引言

　　1. 材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1动物

　　1.1.2 伦理审查

　　1.1.3 细胞

　　1.1.4 药物与主要试剂

　　1.1.5 主要仪器及设备

　　1.2 方法

　　1.2.1体内实验

　　1.2.1.1 动物分组、造模、给药

　　1.2.1.2标本的采集及检测

　　1.2.1.3检测血血肌酐、24 h尿蛋白定量、SOD、CAT、MDA的含量

　　1.2.1.4肾组织病理形态学观察

　　1.2.1.5免疫荧光法检测肾小球足细胞p-JAK2的表达

　　1.2.1.6 Western blotting检测p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1的蛋白表达

　　1.2.2体外实验

　　1.2.2.1 细胞培养

　　1.2.2.2健脾清化方冻干粉制备

　　1.2.2.3 细胞分组及给药

　　1.2.2.4 CCK-8法检测足细胞活力

　　1.2.2.5流式细胞术检测足细胞凋亡率

　　1.2.2.6 DCFH-DA荧光探针检测各组足细胞ROS的水平

　　1.2.2.7 Western blotting检测足细胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1的蛋白表达

　　1.2.2.8 RT-qPCR检测足细胞中BAD、BAX、Bcl-2、Caspase3、P21的mRNA表达

　　1.2.2.9统计分析

　　2结果

　　2.1各组小鼠生化指标检测水平

　　2.2各组小鼠氧化应激指标检测水平

　　2.3各组小鼠肾脏组织学观察结果

　　2.3.1光镜

　　2.3.2电镜

　　2.4各组小鼠肾小球足细胞p-JAK2的表达

　　2.5 各组小鼠p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1的蛋白表达结果

　　2.6阿霉素对足细胞活力的影响

　　2.7健脾清化方对阿霉素损伤足细胞活力的影响

　　2.8各组足细胞凋亡的结果

　　2.9各组细胞ROS荧光的结果

　　2.10各组足细胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1的蛋白表达结果

　　2.11各组足细胞BAX、Caspase3、BAD、Bcl-2、p21、IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表达结果

　　2.12 C-A1对足细胞p-JAK2/JAK2蛋白表达的影响

　　2.13 C-A1对各组足细胞p-STAT3/STAT3蛋白表达的影响

　　3．讨论