摘要：左旋氨氯地平(S-amlodipine， S-AM)是一种降压药，在高血压患者中被广泛使用，部分患者更是长期使用。然而，作为一种非抗生素药物，在其长期胁迫下，细菌是否会进化出抗生素抗性，我们对此一无所知。为了探讨S-AM暴露对细菌抗生素耐药性的影响，本研究针对肠道固有的条件致病菌肺炎克雷伯菌进行了为期60 d的2 mg·L-1 S-AM胁迫下体外进化实验。通过抗生素敏感性测试确定了进化菌株对6种抗生素的耐药性；运用基因组测序技术、荧光定量PCR分析及生物信息学分析，深入探究了S-AM诱导细菌抗生素耐药性的机制。结果显示，在S-AM暴露下肺炎克雷伯菌的突变频率从10-7增加到1.5×10-1；进化菌株的胞内活性氧(reactive oxygen species， ROS)水平显著提高；同时对多黏菌素、卡那霉素、氯霉素、红霉素和莫西沙星表现出更高的耐药性。基因组学分析结果显示，在进化菌株中发现了3个非同义单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， SNP)突变位点、1个同义SNP突变位点、2个基因间的SNP和1个基因间的插入位点。其中，突变的crrB基因协同crrA基因提高了进化菌株细胞膜脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)脂质A组分的修饰，增加了细菌细胞膜表面的正电荷并阻止多黏菌素与细胞相互作用，从而提高了肺炎克雷伯菌对多黏菌素的耐药性。荧光定量PCR的结果显示，S-AM暴露下双组分调节系统基因(如crrAB、phoPQ、pmrAB和pmrDFIK)、多药外排泵基因(如emrD和oqxAB)以及固有耐药基因(如aadA2)的表达水平升高，这可能是导致细菌多种抗生素耐药性增加的原因。总之，我们的研究首次发现S-AM胁迫下肺炎克雷伯菌对多种抗生素产生耐药性，并阐明了潜在的分子机制，为长期用药患者的健康风险提出预警，并为进一步研究S-AM长期胁迫下的广泛肠道细菌耐药性奠定基础。
文章目录
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 材料
1.1.1 实验菌株
1.1.2 主要试剂和仪器
1.2 方法
1.2.1 菌株活化及分子生物学鉴定
1.2.2 细菌体外进化实验
1.2.3 突变频率测定
1.2.4 活性氧检测
1.2.5 抗生素敏感性测定
1.2.6 全基因组测序和生物信息学分析
1.2.7 肺炎克雷伯菌系统发育分析
1.2.8 细菌总RNA的提取和实时荧光定量PCR检测
2 结果(Results)
2.1 S-AM胁迫下细菌突变频率和活性氧水平增加
2.2 S-AM胁迫促进肺炎克雷伯菌多种抗生素耐药性的发展
2.3 S-AM胁迫诱导肺炎克雷伯菌基因组突变
2.4 S-AM胁迫诱导的双组分调节系统、多药外排泵及固有耐药基因的转录调控导致细菌对多种抗生素耐药性增加
3 讨论(Discussion)
