目的 建立一种可同时检测十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和莫尼茨绦虫等4种山羊肠道寄生虫的多重PCR检测方法,并初步评估其检测效能。方法 基于GenBank中十二指肠贾第虫(GenBank登录号:XM001710026.2)、微小隐孢子虫(GenBank登录号:XM626998.1)、毕氏肠微孢子虫(GenBank登录号:KJ719492.1)和莫尼茨绦虫(GenBank登录号:OM296991.1)相应基因的保守序列设计4对特异性引物,建立并优化可同时检测上述4种寄生虫的多重PCR方法。2022年10—12月,从广东省湛江市4个山羊养殖场采集116份新鲜山羊粪便样本,其中96份用于所建立多重PCR方法的检测效能评价、20份作为样本检测的本底对照。分别采用单病原PCR检测方法及本研究所建立的多重PCR方法,对96份山羊粪便DNA样本进行检测。以单病原PCR检测结果为金标准,计算多重PCR法的检测灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。结果 本研究所建立的多重PCR方法可同时扩增出十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和莫尼茨绦虫特异性基因片段,其大小分别为1 400、755、314 bp和585 bp,检出限为≥102拷贝数的病原DNA克隆质粒;该方法对日本血吸虫、羊前后盘吸虫、细粒棘球绦虫、芽囊原虫和平腹吸虫基因扩增结果均为阴性。采用单病原PCR和所建立的多重PCR方法检测96份山羊粪便DNA样本,40份(40/96,41.67%)粪便DNA经单病原PCR检测出现阳性扩增产物,其中39份经多重PCR检测亦出现阳性扩增产物,平均符合率为97.50%(39/40)。96份样本中,多重PCR方法分别检出十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫、莫尼茨绦虫感染阳性26(27.10%)、22(22.90%)、24(25.00%)、9份(9.40%),与单病原PCR检测结果一致。以单病原PCR检测结果为金标准,多重PCR法对山羊粪便样本中十二指肠贾第虫、毕氏肠微孢子虫、微小隐孢子虫和莫尼茨绦虫DNA检测灵敏度分别为96.15%、95.83%、100.00%、100.00%,阴性预测值分别为98.90%、98.92%、100.00%、100.00%,阳性预测值均为100.00%。结论 本研究建立了一种可同时检测十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和莫尼茨绦虫等4种山羊常见寄生虫的多重PCR方法,该方法灵敏度高、特异性好,适用于大规模羊群粪便样本快速筛查。
