摘要：微藻光合效率高、适应性强和生物量大，是一种易规模化养殖的优良生物种质。苹果酸酶（malic enzyme， ME）是一种生物体内广泛存在的代谢酶，催化苹果酸脱羧生成丙酮酸和CO2，同时产生NAD（P）H。ME在能量、光合、呼吸和生物合成等代谢过程中发挥重要作用。本研究以栅藻（Scenedesmus quadricauda）为试材，鉴定栅藻苹果酸酶基因SqME并解析其生物学功能，以期为高等植物遗传改良提供优异靶基因。基于栅藻在CO2和光传质效率高、用水量少的生物膜培养条件下的转录组测序（RNA sequencing， RNA-seq）数据，克隆1条高表达且功能注释为ME的基因。应用生信工具系统解析SqME蛋白序列和理化特性。运用本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片瞬时转染方法分析SqME蛋白亚细胞定位。通过遗传转化普通烟草（Nicotiana tabacum）鉴定SqME的生物学功能，并评估其在高等植物遗传改良应用价值。栅藻SqME基因的开放阅读框（open reading frame， ORF）为1 770 bp，编码一个有590个氨基酸的蛋白质，该蛋白定位于叶绿体。蛋白结构和进化树分析表明，SqME属于NADP-ME型，具有典型的ME酶蛋白结构特征。转SqME烟草株系的苹果酸酶活性是对照株系的1.8倍。异源表达SqME使转基因烟草株系叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别提升了20.9%、26.9%和25.2%。与对照植株相比，转基因烟草叶片荧光参数非光化学猝灭系数（non-photochemical quenching， NPQ）提高54.0%，初始荧光（fluorescence origin， Fo）降低30.1%。转基因烟草叶片生物量、总脂和可溶性糖含量分别提高20.5%、25.7%和9.5%。相反，转基因烟叶的淀粉和蛋白质含量分别降低22.4%和12.2%。研究结果表明，栅藻SqME基因编码的酶蛋白具有较强的酶活性。异源过表达SqME能显著增强宿主光合保护机制、光合作用和生物量。SqME还可驱动宿主碳代谢重构，促使更多碳代谢通量导向油脂合成。因此，SqME可应用于高等植物遗传改良，以增进植物的光合固碳能力并促进油脂富集。这些研究发现为栅藻功能基因挖掘及其在高等植物遗传改良的应用提供参考。
文章目录
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.2 实验方法
1.2.1 栅藻SqME基因的鉴定及生物信息学分析
1.2.2 SqME植物表达载体的构建
1.2.3 SqME蛋白的亚细胞定位
1.2.4 烟草遗传转化
1.2.5 转基因烟草叶片生理指标的测定
1.2.6 数据分析
2 结果与分析
2.1 SqME基因克隆及编码蛋白理化特性分析
2.2 SqME蛋白进化树、保守结构域及多序列比对分析
2.3 SqME蛋白的亚细胞定位分析
2.4 SqME在烟草中的异源表达及苹果酸酶活性分析
2.5 过表达SqME对烟草光合作用的影响
2.6 过表达SqME对烟草生物量和油脂富集的影响
3 讨论
4 结论
