摘要：目的：基于5hmC-Seal测序技术和网络药理学对补阳还五汤（BYHW）进行化裁，改善BYHW对糖尿病肾病（DKD）的治疗效果，探索挖掘中药新方的新方法。方法：收集2021年北京大学第三医院内分泌科住院的糖尿病（DM）患者14例，DKD患者15例。对患者血浆中的循环游离DNA（cfDNA）测序，对测序数据处理与筛选后利用时序聚类分析筛选DKD 5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）基因集，并与DKD数据库基因集交叉验证分析，得到DKD基因集。通过中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）和传统中医药百科全书数据库（ETCM）检索BYHW的七种草药成分的靶基因，并与DKD基因集进行交叉分析，寻找疾病和中药成分的共同基因。对相交基因构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络筛选关键基因，在ETCM数据库检索靶向到关键基因的中药，筛选可去除的中药。对非相交DKD基因进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，对DKD相关通路内基因基于机器学习筛选关键基因，并通过GSE30529数据集验证5hmC修饰基因的表达趋势及目标基因作为靶点的可行性。通过中医药资源库（TCMBank）数据库检索靶基因，获取靶向目标基因的化合物及含该化合物的中药，构建“关键靶点-化合物-中药”网络，分子对接技术验证化合物与关键靶点的结合活性。利用TCMSP和ETCM数据库检索候选中药靶向DKD相关基因并计数，筛选加入的中药并组成新方。使用DKD小鼠模型验证新方药效，测定小鼠体质量、随机血糖、尿微量白蛋白（mALB）、血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、苏木素-伊红（HE）染色、过碘酸雪夫（PAS）染色、马松（Masson）染色、免疫荧光、逆转录实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）。结果：交叉分析结果显示，DKD基因集包括507个基因，其中BYHW的靶基因有30个。PPI分析结果表明，贡献度（degree）值前15%的靶基因为白细胞介素-6（IL-6）、Toll样受体4（TLR4）、乳转铁蛋白（LTF）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、甾醇调节元件结合转录因子1（SREBF1），BYHW中桃仁和地龙与关键基因无关并被去除。通过机器学习筛选到10个潜在靶基因，其中TBC1结构域家族成员5（TBC1D5）、RAD51旁系同源物B（RAD51B）和蛋白酶体20S亚基α 6（PSMA6）的表达趋势与GSE30529数据集表达方向一致，可作为药物靶点。“关键靶点-化合物-中药”网络及分子对接技术结果表明，与靶蛋白结合活性好的化合物为精氨酸、甘氨酸、肉豆蔻醚、丝氨酸、酪氨酸，对应121种中药。候选中药靶向DKD相关基因计数结果中，前10位中药为枸杞子、人参、山药、熟地黄、板蓝根、北沙参、麦冬、大蒜、大青叶和土贝母，结合传统中医理论，加减补阳还五汤加入熟地黄和山药。最终，在原方的基础上去桃仁和地龙，加熟地黄和山药，得到由黄芪、当归、赤芍、川芎、红花、地黄、山药组成加减补阳还五汤，动物实验结果表明，加减补阳还五汤可以改善DKD小鼠的肾功能并抑制肾纤维化，且效果较原方更佳。结论：通过结合5hmC-Seal测序技术对BYHW进行化裁，加减补阳还五汤与原方比较具有更好的抑制纤维化改善DKD的作用，阐明了基于表观遗传学化裁中药经方背后的生物医学理论，可能为中药方的挖掘提供新思路。
文章目录
1 材料
1.1 血液样本
1.2 实验药物
1.3 动物
1.4 试剂
1.5 仪器
2 方法
2.1 5hmC-Seal测序
2.2 靶基因筛选
2.2.1 数据处理与分析
2.2.2 时序聚类分析筛选DKD相关基因集
2.2.3 DKD数据库基因集及补阳还五汤靶基因集获取
2.2.4 补阳还五汤靶向DKD的关键基因筛选并靶向中药
2.2.5 KEGG通路分析与GO富集分析
2.2.6 特征选择和分类器构建筛选DKD关键靶基因
2.2.7 DKD关键靶基因转录组调控
2.2.8 网络药理学预测靶向DKD关键靶基因的中药
2.3 加减补阳还五汤的化学组成分析
2.4 动物实验验证
2.5 小鼠肾功能测定
2.5.1 ELISA检测尿液中mALB含量
2.5.2 检测血清中Scr和BUN含量
2.6 HE、PAS、Masso
