摘要：目的 构建小鼠支气管扩张（简称支扩）伴急性感染模型，评价自组装铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）纳米颗粒疫苗rePO-FN的免疫原性及保护效果。方法 ①将6～8周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠（体质量为18～20 g）按随机数字表法分为（n=6）：生理盐水组、弹性蛋白酶低剂量组、弹性蛋白酶中剂量组和弹性蛋白酶高剂量组。采用气管内连续3 d滴注不同剂量弹性蛋白酶的方法构建小鼠支扩模型，生理盐水组气管内滴注30 L生理盐水，弹性蛋白酶低剂量组、弹性蛋白酶中剂量组和弹性蛋白酶高剂量组分别滴注30 μL含有0.65、1.30及2.60 IU弹性蛋白酶的生理盐水溶液。通过ELISA实验比较支扩造模第14、21天小鼠肺部IL-6浓度及肺部病理组织改变情况，判断是否造模成功。②构建携载编码rePO-FN蛋白基因的重组质粒，并用大肠杆菌进行表达。采用亲和层析纯化后对目标蛋白进行复性，从而得到目的蛋白。通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳实验、动态光散射实验、分子筛层析及透射电镜等方法对rePO-FN蛋白的理化性质进行分析。③将C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为（n=10）：PBS组、rePO组、rePO-FN组和Ferritin组。rePO-FN、rePO、Ferritin组分别免疫100 μL含有10 μg rePO-FN、rePO或Ferritin蛋白的PBS缓冲液，PBS组免疫100 μL PBS缓冲液。分别于第0、7、14天肌肉注射免疫，用ELISA法检测血清中特异性抗体。末次免疫7天后使用PA急性感染模型，比较PBS组、rePO组和rePO-FN组生存率和细菌定植差异。将C57BL/6J小鼠滴注2.60 IU弹性蛋白酶构建支扩模型后，按随机数字表法分为（n=10）：支扩PBS组、支扩rePO组和支扩rePO-FN组，于支扩造模21天后进行免疫。末次免疫7天后使用PA急性感染模型，比较各组之间生存率和细菌定植差异。结果 ①与生理盐水组相比，气管内滴注反复弹性蛋白酶可引起小鼠肺组织IL-6浓度升高（P<0.05），且可见不同程度的支气管壁结构破坏、肺泡融合、水肿、中性粒细胞浸润、出血的变化，且随剂量增加严重程度增加，表明成功构建小鼠支扩模型。②成功制备分散性良好的纳米颗粒rePO-FN，平均粒径为91.28 nm，其Zeta电位约为-6.5 mV，粒径分布指数为0.306。分子筛层析测定rePO-FN蛋白的出峰体积为8.80 mL，计算得出rePO-FN颗粒的分子量约为1 400 kDa。③rePO-FN组和支扩rePO-FN组免疫后在PA XN-1菌株急性感染下的生存率显著高于PBS对照组（P<0.05），肺组织细菌定植量分别低于rePO组及支扩rePO组免疫后（P<0.05）。结论 rePO-FN免疫能高效诱导高效的小鼠体液免疫应答，并且在支扩小鼠中有显著保护效果。
文章目录
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 实验动物与菌株
1.1.2 试剂与仪器
1.2方法
1.2.1 小鼠支气管扩张模型的建立
1.2.2 rePO-FN的表达与纯化
1.2.3 rePO-FN的理化性质分析
1.2.4 免疫方法
1.2.5 血清中特异性抗体的检测
1.2.6 rePO-FN的保护效果评价
1.2.7 rePO-FN在支气管扩张模型中的保护效果评价
1.2.8 安全性评估
1.2.9 统计学分析
2 结果
2.1 支气管扩张模型的建立
2.2 rePO-FN蛋白的纯化与结构表征
2.3 rePO-FN蛋白诱导的体液免疫应答
2.4 rePO-FN蛋白免疫保护效果
2.5 rePO-FN蛋白在支气管扩张模型中的免疫保护效果
2.6 rePO-FN蛋白的初步安全
