摘要：目的 构建具有视网膜血管体系空间结构特征和生物活性的内皮化微流控芯片模型，模拟视网膜血管体系中的血栓形成过程并应用于溶栓效果验证。 方法 采用软光刻加工技术制备具有分叉结构和三级管径的体外眼底微血管网络微流控芯片；在芯片通道内注入人源视网膜血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs），通过光学显微镜和细胞骨架染色观察不同时间点内皮细胞的铺设密度及形态特征；利用线粒体膜电位荧光探针（JC-1）和一氧化氮（nitric oxide，NO）染色评估通道内内皮细胞的生物活性，并通过倒置荧光显微镜进行观察；使用数字注射泵模拟人体血液流动，实验分为全血组、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）激活内皮细胞+健康成人全血组及TNF-α激活内皮细胞+TNF-α激活全血组（血液均混合钙黄绿素染色剂），评估各组在不同流速下形成的血栓面积比率（血栓面积比率%=血栓面积/通道面积）；设置生理盐水与重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant human tissue-type plasminogen activator，rtPA）组，应用内皮化微流控芯片血栓模型验证溶栓效果；细胞核染色与NO染色，结合内皮化微流控血栓模型，评估生理盐水与rtPA在不同干预阶段（血栓形成前、血栓形成后及溶栓后）对内皮细胞功能的影响。 结果 成功构建了三级微流控芯片血管模型，其直径分别为300、200和100 μm；内皮细胞注入培养72 h后，完全覆盖管壁，光学显微镜和细胞骨架染色显示细胞间排列紧密；JC-1和NO染色证实内皮细胞生物活性良好；相同流速下，与全血组相比，TNF-α激活内皮细胞+健康成人全血组与TNF-α激活内皮细胞+TNF-α激活全血组均观察到通道内血栓面积比率明显增加（P＜0.0001）；且3.5 μL/min流速下TNF-α激活内皮细胞+TNF-α激活全血组血栓面积比率显著高于其余组（P＜0.0001）；rtPA组的溶栓效果显著强于生理盐水组（P＜0.0001），不同干预阶段微流控芯片通道内内皮细胞贴壁良好，血栓形成可造成微流控芯片通道内内皮细胞NO分泌增多。 结论 本研究成功构建了具有内皮生物活性、模拟视网膜血管结构的体外模型，并进一步构建视网膜体外血栓模型，为视网膜微血管疾病的病理生理机制研究及血栓类疾病的治疗策略开发提供了可靠的实验平台。
文章目录
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1主要试剂
1.1.2主要仪器
1.2方法
1.2.1制备PDMS微血管网络模型微流控芯片
1.2.2内皮化微流控芯片
1.2.3 内皮化的微流控芯片生物活性检测
1.2.4微流控芯片通道内血栓形成
1.2.5微流控芯片血栓模型的应用
1.2.6溶栓前后模型通道内内皮形态和活性检测
1.3统计学分析
2结果
2.1 成功构建模拟视网膜三级血管网络的PDMS微流控芯片模型
2.2成功构建模拟眼底视网膜血管生物活性的微流控芯片内皮化模型
2.2.1光学显微镜观察细胞形态及数量
2.2.2倒置荧光显微镜观察结果
2.3微流控芯片具有生物活性
2.4微流控芯片通道内血栓形成
