摘要：【目的】金花菌是黑茶中的一类潜在益生真菌，能赋予茶叶独特的味道，并具备补充人体所需维生素和矿物质、生津止渴、分解油腻、降脂减肥等多种保健作用，是评价茯砖茶和六堡茶品质的重要指标之一。本研究分析了金花菌的遗传多样性及遗传结构，建立并优化金花菌ISSR-PCR反应体系，旨在为进一步利用ISSR分子标记技术系统研究金花菌遗传多样性及其种内种间亲缘关系提供方法。【方法】以冠突曲霉（Aspergillus cristatum）的DNA作为模板，采用单因素实验对影响ISSR-PCR反应体系的模板DNA用量、引物、PCR Mix用量以及ISSR-PCR循环次数等4个因素进行优化，结果用4个金花菌种Aspergillus cristatum、谢瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri）、假灰绿曲霉（Aspergillus pseudoglaucus）、Aspergillus cibarius的菌株对反应体系进行稳定性验证。【结果】建立了金花菌ISSR-PCR最优反应体系，其组成包括50 ng/μL的模板DNA 0.3 μL、10 μmol/μL的引物0.8 μL、2×SanTaq PCR Mix用量9.0 μL，ddH2O 9.9 μL，总体积20 μL。ISSR-PCR反应条件：94.0 ℃预变性5 min；94.0 ℃变性30 s，退火30 s，72.0 ℃延伸2 min，循环次数为35次；72.0 ℃终延伸10 min。使用4株不同的金花菌对所获ISSR-PCR最优反应体系进行稳定性验证表明其具有高多态性和可重复性。采用此最优反应体系筛选出11条多态性和重复性好可适用于金花菌遗传多样性分析的ISSR引物并确定其退火温度。【结论】本研究建立并优化了金花菌的ISSR-PCR反应体系，结果具有高多态性和可重复性，为后续金花菌遗传多样性分析提供了新方法。
文章目录
0 引言
1 材料和方法
1.1试验材料
1.1.1供试菌株
1.1.2 供试试剂
1.2 试验方法
1.2.1 金花菌基因组DNA的提取
1.2.2 金花菌ISSR-PCR反应体系优化
1.2.3 ISSR引物及退火温度的筛选和确定
1.2.4 ISSR-PCR最优反应体系的稳定性验证
2 结果与分析
2.1 模板DNA用量对金花菌A. cristatum ISSR-PCR的影响
2.2 引物用量对金花菌A. cristatum ISSR-PCR的影响
2.3 PCR Mix用量对金花菌A. cristatum ISSR-PCR的影响
2.4 PCR循环次数对金花菌A. cristatum ISSR-PCR的影响
2.5 金花菌ISSR-PCR引物的筛选及其退火温度的确定
2.6 金花菌ISSR-PCR最优反应体系的稳定性验证
3 讨论
4 结论
