酸性磷酸酶是一种在酸性条件下催化水解各种磷酸单酯的酶,其通过水解磷酸单酯将底物分子的磷酸基团除去,并生成磷酸根离子和自由的羟基。酸性磷酸酶广泛分布于动植物及微生物中,其具有的酶解活性是细胞发挥功能性作用的基础步骤,已知其在植物高效利用土壤中磷元素、恶性肿瘤的临床诊断和预后应用、癌症治疗靶向制剂和利用固定化技术制作生物传感器等应用中发挥重要作用。摩根氏菌酸性磷酸酶作为一种非特异性的磷酸-不可抑制酸性磷酸酶,具有广泛的底物非特异性,可以催化多种磷酸单酯的水解。相比于其他酸性磷酸酶,摩根氏菌酸性磷酸酶在发挥酶解作用时,不需要金属离子辅助因子,且不容易受到磷酸单酯的抑制,这可以进一步为研究酸性磷酸酶的作用与功能提供一条新思路。目前,从各种动植物体内分离提取及利用大肠杆菌表达系统对酸性磷酸酶进行表达的研究较多,但利用毕赤酵母体系表达摩根氏菌酸性磷酸酶的研究较少。此外,相比于上述制备方法,毕赤酵母体系具有高效、易于诱导表达和适合高密度培养等特点。因此,本研究尝试利用毕赤酵母表达系统对其进行表达,设计构建p PICZαA-APT和p GAPZαMUT-APT两种毕赤酵母表达体系表达摩根氏菌酸性磷酸酶。其中,GAPZαMUT载体是由表达载体p GAPZαA及融合标签-6His-Asn-Gly共同构建成的重组载体p GAPZαA-6His-Asn-Gly,其可以方便纯化及提高蛋白表达产量。而后利用抗性筛选出PIC-APT4作为后续工程菌并进行蛋白纯化、培养条件优化、中试发酵并进行酶学性质的初步探究。具体研究内容如下:1、酸性磷酸酶的毕赤酵母表达体系构建本研究以野生型摩根氏菌酸性磷酸酶基因为出发序列,针对毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化,在酸性磷酸酶基因序列两端分别加入酶切位点XhoⅠ和NotⅠ、XhoⅠ和Eco RⅠ,构建出p PICZαA/p GAPZαMUT-APT两种表达载体,双酶切验证结果显示在816bp处出现特异性条带与目的基因片段相符,证明重组质粒构建成功。对重组质粒进行线性化处理后导入毕赤酵母感受态细胞,通过博来霉素抗性筛选和蛋白凝胶电泳验证蛋白在30k Da处有特异性条带与预期相符。利用亲和层析对蛋白进行纯化、BCA法测定蛋白含量和对硝基苯磷酸二钠法测定酶活力,结果显示PIC-APT4的蛋白含量为61.2mg/L、酶活为38.5U/m L;GAP-APT2的蛋白含量为41.3mg/L、酶活为31.9U/m L;GAP-APT3的蛋白含量为45.8mg/L、酶活为34.3U/m L,对PIC-APT4进行基因测序后最终选择其作为工程菌。2、PIC-APT4培养条件优化利用单因素实验及Box-Behnken实验研究碳源浓度、诱导剂浓度、p H和温度对蛋白表达的影响。单因素优化的结果显示蛋白最佳表达的碳源种类为葡萄糖,碳源浓度为2%,氮源种类为蛋白胨,氮源浓度为2%,诱导剂浓度为1.5%,p H为6.5,温度为28℃,接种量为2%,发酵时间为96h。在此基础上进行Box-Behnken设计四因素三水平实验,考察自变量为氮源浓度、诱导剂浓度、温度、p H,因变量为蛋白产量,利用回归模型对数据分析预测,得出理论优化工艺条件为:碳源浓度2.21%、诱导剂浓度1.34%、p H6.49、温度28.06℃。该条件下的蛋白表达量为73.3mg/L。3、PIC-APT4中试发酵在优化实验的基础上,进行了50L发酵罐的中试发酵。分析一级种子液、二级种子液接种的最适时间,结果显示接种时间分别为16h和18h。发酵时分为三个阶段,分别为葡萄糖批式发酵、葡萄糖补料培养和甲醇补料诱导。菌体生长阶段补加葡萄糖补料培养基补料6h,蛋白表达阶段补加甲醇诱导,整个发酵过程共培养诱导96h。通过粗分离、超滤、纯化及透析浓缩等步骤对发酵液进行处理,蛋白凝胶电泳验证蛋白在30k Da处有特异性条带,产量为217.5mg/L,酶活力为133.6U/m L,表明已得到较纯的目的蛋白产物。4、酶学性质初步研究本研究利用对硝基苯磷酸二钠法对酸性磷酸酶酶学性质进行初步探究,结果显示酸性磷酸酶最适p H为5.5,在过酸过碱环境中不能稳定存在。最适温度为35℃且对温度较为敏感,高温会导致酶活下降明显。反应体系中存在Ca2+时对活性具有较强的抑制作用,存在Mg2+和Zn2+时对活性没有明显的促进作用,存在Co2+时对活性有较强的促进作用。综上所述,本研究成功构建了p PICZαA-APT和p GAPZαMUT-APT表达载体并筛选出工程菌。通过对PIC-APT4工程菌进行表达优化、中试发酵,提高了酸性磷酸酶的表达量。此外,还初步探究了酸性磷酸酶的酶学性质,为酸性磷酸酶后续的酶学研究奠定了基础。
