维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,A.veronii)是广泛存在于水生环境中的一种致病性病原菌,隶属气单胞菌属,它可导致包含人在内的哺乳动物患脑膜炎、败血症等疾病,导致水生生物产生鱼鳍腐烂等症状。相关报道表明,A.veronii的毒力不断增强,由该细菌产生的病症案例越发频繁,研究A.veronii的毒力相关基因至关重要,以便对该细菌更好的探索与防治。Fur基因作为铁摄取调节蛋白,在细菌中起关键主导作用。当细菌自身缺铁时释放铁离子,体内铁含量过高时抑制铁离子,维持机体内铁环境的稳态。Fur还能作为全局调控因子,不仅可以调节铁相关表达,还可以调控与铁无关的通路。前期课题组对于A.veronii强毒、弱毒、无毒三类菌株的基因组学分析,发现相较于其他弱毒株来说,A.veronii TH0426作为强毒株,铁摄取调节蛋白其独有的,推测其作为毒力因子,对于A.veronii的毒性起决定性作用。本试验为了探究A.veronii Fur基因的功能与致病能力的影响,构建了重组自杀性质粒p PE112-UDFur,通过同源重组成功构建Fur基因的缺失株ΔFur;在此基础上,利用广宿主表达质粒成功构建回补株C-Fur。比较分析所构建成功的缺失株ΔFur与回补株C-Fur与野生株A.veronii的生物学特性;试验结果发现:Fur缺失后,ΔFur生长能力略低于野生株,对抗生素的耐药性未发生显著变化;通过透射电镜观察,发现鞭毛断裂,游动能力显著降低;扫描电镜观察到部分菌体形态不一,生物被膜交联结构变得松散,且结晶紫染色分析结果支持生物被膜显著降低结果;缺失株ΔFur对鲤鱼上皮瘤(Epithelioma papillosum cyprinid,EPC)细胞的黏附侵袭能力显著下降,细胞毒性也有所减弱,在斑马鱼攻毒试验中ΔFur的致病力下降了2.3倍。为了探究Fur基因的调控机制,以野生株作为对照组,对ΔFur进行转录组测序分析,共筛选出差异基因2242个,其中上调基因993个,下调基因1249个。KEGG富集分析发现,Fur基因缺失后,主要影响细菌趋化性、鞭毛组装、双组份系统以及细菌分泌系统等相关通路,其表达量差异显著;并且生物学特性分析所产生的现象与转录组结果相吻合。本研究成功构建了A.veronii Fur基因缺失株ΔFur和回补株C-Fur,并将其和野生株进行比较,Fur基因缺失后,发现其对EPC细胞的毒性、黏附与侵袭能力、细菌自身的运动性、生物被膜的形成以及致病性均显著降低。说明Fur基因作为A.veronii的全局调控因子,发挥着重要的作用,并对A.veronii致病机制的探索具有一定的推动作用,以期为防治A.veronii及其疫苗的研发提供理论依据。
