副结核是由鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis,MAP)引起的,以反刍动物为主的慢性肠道炎症性传染病。与牛结核分枝杆菌相似,初次感染会导致在免疫控制下发生持续感染。在某些情况下,免疫控制可能受损,导致肉芽肿性回肠炎、吸收不良、消瘦和死亡,给养殖业造成相当大的经济损失。此外,病原体也被认为是人类克罗恩病的可能原因。迄今为止,还没有开发出能引起保护性免疫的副结核疫苗,研究开发此类疫苗迫在眉睫。本研究以Ad5为载体,构建副结核分枝杆菌35kDa蛋白基因重组腺病毒,并通过免疫小鼠研究重组腺病毒表达的35kDa蛋白的免疫原性,为研制副结核病新型疫苗奠定基础。以MAP基因组DNA为模板,对35kDa蛋白基因进行PCR大量扩增,纯化并回收目的基因,再和克隆载体pMD19-T连接,构建pMD19T-35重组克隆质粒。将重组克隆质粒pMD19T-35用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切,纯化回收目的基因,与腺病毒表达载体pacAd5 CMVK-NpA连接,构建出重组腺病毒表达质粒pacAd5 CMV-35,将其与腺病毒骨架质粒pacAd5 9.2-100分别经Pac Ⅰ限制性内切酶线性化,在脂质体转染试剂LipoFiterTM的作用下,共转染到HEK293细胞内同源重组,从而获得重组腺病毒rAd5 CMV-35。运用病毒基因组PCR验证目的基因表达情况,反转录PCR(RT-PCR)验证35kDa蛋白基因转录水平的表达情况,进一步应用间接免疫荧光检测35kDa蛋白基因翻译水平的表达情况。大量扩增重组腺病毒rAd5 CMV-35并纯化,使用TCID50法测定纯化后的重组腺病毒rAd5 CMV-35和空载毒rAd5 CMVK-NpA半数组织感染量。将重组腺病毒rAd5 CMV-35、空载腺病毒rAd5 CMVK-NpA、PBS缓冲液、灭活MAP和pET32a-35原核表达蛋白,对5周龄BALB/c雄性小鼠采用肌肉注射的方法进行免疫,每两周后加强免疫,共免疫三次,末次免疫2周后处死小鼠,使用流式细胞术检测小鼠脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群及分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α细胞因子的T淋巴细胞数量;使用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中IgG抗体水平,评估重组腺病毒疫苗对小鼠的细胞免疫和体液免疫水平的影响。末次免疫6周后,进行攻毒实验,腹腔注射1×108CFU活MAP,攻毒后8周,取小鼠结肠、肝和脾,经细菌检测和病理检测,从而分析重组腺病毒rAd5 CMV-35对MAP感染的抵抗效果。结果表明,与对照组相比,重组腺病毒组抗体水平有一定程度提升,显示该重组腺病毒疫苗能刺激机体产生针对35kDa蛋白的高水平特异性抗体;重组腺病毒疫苗组的CD4+和CD8+T细胞显著增多,而且IL-2、IFN-γ和TNF-α细胞因子水平均高于对照组,说明重组腺病毒rAd5 CMV-35能够介导机体产生较强的细胞免疫反应。重组腺病毒疫苗免疫组小鼠攻毒8周后,结肠、肝和脾组织病理结果表明,重组腺病毒疫苗可以降低病理损伤程度,减缓病程。综上,本研究以编码表达副结核分枝杆菌35kDa蛋白基因MAP2121c为对象,构建腺病毒载体疫苗,所构建的腺病毒载体疫苗能够使小鼠的体液与细胞免疫水平得到一定程度的提高,对副结核分枝杆菌感染具有一定的抵抗效果,为新型副结核疫苗的研制奠定基础,为副结核病的防控提供新思路。
