目的 利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复机制构建重组人丁酰胆碱酯酶（rhBChE）基因敲入山羊胎儿成纤维细胞株（GFF），为后续制备表达rhBChE的山羊提供细胞株。方法 针对山羊β-酪蛋白（CSN2）基因设计并筛选有效sgRNA靶点，通过电转染、流式分选和PCR产物测序，在山羊乳腺上皮细胞（GMEC）中确认CSN2基因有效sgRNA；构建靶向有效靶点的红色荧光报告基因同源修复载体（P2A-mCherry），利用流式细胞术检测该靶点的定向整合及表达效率；构建靶向山羊胎儿成纤维细胞CSN2基因有效靶点的rhBChE同源修复载体（P2A-rhBChE），通过电转染和流式分选rhBChE阳性细胞克隆，经PCR产物测序鉴定rhBChE定向整合的阳性细胞株。结果 确定sgRNA4为山羊CSN2基因的有效靶点，该靶点可用于目的基因的定向整合；成功构建3株rhBChE定向整合的阳性细胞株。结论 靶向山羊CSN2基因的rhBChE阳性细胞株可为应用体细胞克隆技术制备乳腺表达rhBChE的山羊奠定基础。
