摘要：目的 拟建立一种模拟高脂高糖引起的小鼠胚胎海马颗粒下区神经干细胞(neural stem cell,NSC)损伤的体外模型,探索CDC42在高脂高糖相关NSC损伤中的作用。方法 培养胚胎小鼠NSC,利用Sox2与Nestin免疫荧光染色明确培养细胞的干性与纯度。采用不同浓度葡萄糖及氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)分别培养和共培养神经干细胞,利用CCK8检测细胞活力,明确影响NSCs增殖的适宜糖、脂浓度,并采用高脂高糖共培养(HHM)或普通培养基(RM),CCK8法检测其对NSCs增殖、划痕实验及Transwell迁移实验检测其对NSCs迁移能力的影响。提取10周龄db/db动物,db+动物海马组织匀浆与不同条件体外培养NSC的蛋白匀浆,Western blot法检测CDC42表达量。并在体外实验中采用10μmol/L ZCL278(CDC42特异性抑制剂)与高脂高糖共培养,检测干预CDC42对高脂高糖引起的NSC增殖障碍的治疗作用。结果 10～40 mmol/L的葡萄糖与25～35μg/mL的ox-LDL均可造成体外培养神经干细胞的增殖障碍。最终选定10 mmol/L葡萄糖+25μmol/L oxLDL作为HHM相关NSC损伤的模型,该浓度可在72 h内持续抑制神经干细胞的增殖,划痕实验与Transwell迁移实验也显示,同一浓度的糖脂损伤显著抑制了NSC的迁移能力。糖尿病小鼠海马及NSC内CDC42表达增加。在体外使用CDC42的特异性抑制剂ZCL278可升高HHM培养的NSCss细胞活力,提示其可部分逆转HHM相关NSCs增殖障碍。结论 10 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L ox-LDL可模拟糖尿病动物神经干细胞的糖脂损伤,影响神经干细胞的增殖与迁移;CDC42的高表达参与了高脂高糖引起的神经干细胞增殖障碍;体外给予CDC42的特异性抑制剂ZCL278可部分逆转高脂高糖引起的神经干细胞增殖障碍。本研究结果可为糖脂代谢异常相关的NSC增殖迁移障碍提供体外模型,CDC42特异性抑制剂ZCL278可部分逆转高脂高糖相关的NSC增殖障碍。
文章目录
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 试剂与仪器
1.2 方法
1.2.1 胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养及鉴定
1.2.1.1 神经干细胞的分离
1.2.1.2 神经干细胞的培养和传代
1.2.1.3 神经干细胞的培养和鉴定
1.2.2 神经干细胞增殖、迁移功能鉴定
1.2.2.1 细胞增殖能力CCK-8实验
1.2.2.2 细胞迁移能力-划痕实验
1.2.2.3 细胞迁移能力-Transwell迁移实验
1.2.3 体外药物干预措施
1.2.4 Western blot
1.3 统计学方法
2 结果
2.1 高糖或高脂培养对神经干细胞增殖的影响
2.2 高脂高糖共培养对神经干细胞增殖的影响
2.3 高脂高糖共培养对神经干细胞迁移的影响
2.4 糖尿病小鼠海马区与高脂高糖培养神经干细胞中CDC42的表达变化
2.5 CDC42特异性抑制剂ZCL278对高脂高糖培养引起的神经干细胞增殖障碍的影响
3 讨论
