低聚半乳糖(GOS)是一种功能性低聚糖，主要利用乳糖酶(Lac)进行酶法合成。本研究利用类弹性蛋白多肽(ELP)标签和分子粘合剂“SpyTag/SpyCatcher”建立了快速高效的乳糖酶分离纯化方法，并研究了获得的重组乳糖酶(Lac-ELP)的酶学性质及其在合成GOS中的应用。从产马乳酒乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)ZW3中克隆得到乳糖酶酶基因lac，并将lac连接到“Spytag”标签，在大肠杆菌DH5α中表达获得了含有Spytag的乳糖酶Lac-Spytag。通过基因合成获得了编码ELP的基因片段elp，并将elp接到“Spycatcher”编码基因的下游，在大肠杆菌DH5α中表达获得了含有SpyCatcher的ELP标签SpyCatcher-ELP。随后，通过SpyTag和SpyCatcher的自发连接，将Lac-SpyTag和SpyCatcher-ELP进行融合，获得重组乳糖酶Lac-SpyTag-SpyCatcher-ELP(Lac-ELP)。利用ELP标签的可逆相变循环(ITC)技术，对Lac-ELP进行分离纯化，成功获得了分子量大小为115 KDa的Lac-ELP，回收效率为73.8%。随后，比较ELP标签对Lac活性的影响。Lac-ELP和Lac的最适温度均为50℃，最适pH均为7.0，但Lac-ELP比Lac表现出更好的热稳定性和pH稳定性。最后，以乳糖为底物研究了Lac-ELP在制备GOS中的应用。结果表明，Lac-ELP表现出较好的转糖苷活性，底物浓度400 mg/mL，Lac-ELP添加量10 U/g乳糖，35℃反应24 h后，GOS产率可达33.23%。综上，本研究建立的基于ELP的乳糖酶纯化技术简便，成本低，可以快速获得高活性的重组乳糖酶，为GOS的工业合成提供参考。
文章目录
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种、质粒及引物
1.1.2 试剂
1.1.3 主要仪器与设备
1.2 实验方法
1.2.1 原核表达载体的构建与验证
1.2.2 乳糖酶和ELP标签的表达
1.2.3 乳糖酶的ITC纯化方法
1.2.4 Lac-ELP纯化条件的选择及酶活力测定
1.2.5 酶学性质的测定
1.2.6 GOS的测定
1.2.7 乳糖酶合成GOS条件优化
2 结果与讨论
2.1 重组质粒验证
2.2 表达和纯化分析
2.3 Lac-ELP纯化条件的选择
2.4 酶学性质的测定
2.5 GOS的测定
2.6 乳糖酶合成GOS条件优化
3结论
