摘要：为了解决毕赤酵母遗传操作效率低且流程繁琐的问题，提高其应用价值，构建并优化分泌型遗传操作工具。首先，以α-淀粉酶为报告蛋白，通过融合自主复制序列构建非整合型表达质粒；其次，借助通用引物和POE-PCR，快速筛选评估与目的蛋白最匹配的内源信号肽；最后，构建以亚磷酸盐为唯一磷源的营养依赖型筛选标记。结果表明：非整合型质粒表达α-淀粉酶的酶活分别是整合型质粒的2倍和1.6倍；以FLO10，EXG1和MSB2为信号肽引导的α-淀粉酶酶活分别是常规信号肽α-MF的2.5倍、1.94倍和1.75倍；亚磷酸脱氢酶基因（ptxD）成功筛选出异源表达α-淀粉酶的重组菌株。研究简化了基因操作流程，改进了遗传操作工具，开发的绿色安全且低成本的营养依赖型筛选标记，有助于毕赤酵母分泌表达系统的应用和推广。
文章目录
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 表达载体的构建
1.2.1 带有2种不同复制子的非整合型质粒的构建
1.2.2 淀粉酶表达质粒的构建
1.2.3 含有信号肽质粒的构建
1.2.4 亚磷酸脱氢酶基因表达质粒的构建
1.3 毕赤酵母转化子的筛选与鉴定
1.4 α-淀粉酶的酶活检测
2 结果与分析
2.1 非整合型载体的构建
2.1.1 重组表达载体的构建
2.1.2 非整合型质粒的功能验证
2.1.3 以mitoARS和OPT-panARS为复制子的载体淀粉酶的表达情况比较
2.2 信号肽的分析与评估
2.2.1 α-MF信号肽的优化
2.2.2 毕赤酵母内源信号肽的预测
2.2.3 毕赤酵母内源信号肽的评估
2.3 营养依赖的筛选标记的建立
2.3.1 亚磷酸脱氢酶基因作为筛选标记的可行性与有效性
2.3.2 亚磷酸脱氢酶基因作为筛选标记的稳定性
2.3.3 亚磷酸脱氢酶基因表达菌株的生长情况
3 结 语
