摘要：为探明耐寒的枳和不耐寒的柠檬COR8基因响应低温胁迫差异的原因，本研究采用PCR技术克隆枳PtCOR8基因及柠檬同源基因ClCOR8的CDS序列和启动子序列，比对分析它们的核酸序列和氨基酸序列差异；同时构建pPtCOR8-PtCOR8::YFP、35S-PtCOR8::YFP的融合植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化不耐寒柠檬，观察枳pPtCOR8启动子对低温胁迫的响应情况。结果显示，枳和柠檬COR8基因CDS序列同源性为99.03%；编码氨基酸序列同源性为98.06%；枳和柠檬COR8蛋白均存在5个跨膜结构，具有跨膜功能；二级结构均由α-螺旋、延伸链、无规则卷曲及β-折叠构成，主要为α-螺旋；三级结构相同。枳和柠檬COR8启动子同源性为87.63%，存在较大差异，顺式作用元件分析发现均含有启动子基本元件CAAT-box和TATA-box，但枳比柠檬多了4个抗逆相关的元件，分别是CCAAT-box、TC-rich repeats、CGTCA-motif、TGACG-motif元件。转基因柠檬阳性苗的荧光观察结果显示，转35S::PtCOR8::YFP载体的柠檬在30 ℃和4 ℃均有荧光表达；转pPtCOR8::PtCOR8::YFP载体的柠檬在30 ℃无荧光，只在4 ℃有荧光表达，说明枳pPtCOR8启动子受低温诱导，是低温诱导型启动子，枳PtCOR8基因是冷诱导基因。研究结果表明枳和柠檬COR8基因同源性高，蛋白质三级结构相同，但启动子构成存在差异，推测两者响应低温胁迫差异的原因可能源于启动子，该结果为进一步研究COR8基因的功能奠定了基础。
文章目录
1结果与分析
1.1枳和柠檬COR8基因扩增及序列比对
1.2枳和柠檬COR8蛋白的氨基酸序列及结构
1.3枳和柠檬COR8基因启动子扩增及序列比对
1.4枳和柠檬COR8启动子元件分析
1.5 PtCOR8转基因柠檬抗性植株的获得及PCR鉴定
1.6 PtCOR8转基因柠檬抗性植株的YFP荧光检测
2讨论
3材料与方法
3.1 试验材料与冷胁迫处理
3.2 枳和柠檬叶片总DNA、RNA的提取及cDNA合成
3.3 枳和柠檬COR8基因CDS序列和启动子序列的克隆
3.4 枳和柠檬COR8基因结构分析、启动子结构分析
3.5 农杆菌介导的柠檬遗传转化
3.6 柠檬抗性芽叶片总DNA的提取和PCR鉴定
3.7 柠檬转基因阳性芽低温处理
