摘要：旨在探究猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N，pAPN)基因敲除的猪空肠上皮细胞系(intestinal porcine epithelial cell line J2，IPEC-J2)介导猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)感染的特征，为深入了解pAPN基因在TGEV感染过程中的作用机制提供理论依据。研究分为pAPN基因敲除IPEC-J2组(IPEC-J2-KO组)、野生型IPEC-J2组(IPEC-J2-WT组)和未接种TGEV的野生型IPEC-J2组(Mock组)3组，每组设置3个重复。首先通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)确定IPEC-J2接种TGEV毒株后收取细胞样品的最佳时间节点；其次，对IPEC-J2-KO进行了脱靶效应检测；然后，通过qPCR、蛋白免疫印迹(western blot，WB)、间接免疫荧光分析(indirect immunofluorescence assay，IFA)和50%组织细胞感染量(50% tissue culture infective dose，TCID50)对接种TGEV的IPEC-J2-KO、IPEC-J2-WT及Mock进行感染特征分析；最后，通过WB检测IPEC-J2-KO、IPEC-J2-WT和Mock中NF-κB p65及其磷酸化蛋白pp65的表达情况。qPCR结果显示，接毒24 h是收集细胞样本以评估TGEV对IPEC-J2影响的最佳时间节点；脱靶分析结果显示，在IPEC-J2-KO中未检测到脱靶效应；病毒感染特征分析结果显示，与IPEC-J2-WT相比，IPEC-J2-KO内病毒拷贝数、病毒滴度均极显著降低(P<0.001)，与Mock相比，IPEC-J2-KO内病毒拷贝数、病毒滴度均无显著差异(P>0.05)，且IPEC-J2-KO内未检测到TGEV-N蛋白的表达；此外，与Mock相比，接种TGEV后，IPEC-J2-WT组NF-κB p65的磷酸化水平极显著上调(P<0.001)，而IPEC-J2-KO组无显著差异(P>0.05)。本研究表明IPEC-J2-KO可有效抵抗TGEV的感染，接种TGEV未影响IPEC-J2-KO中先天免疫相关信号通路中转录因子NF-κB的活性。该研究为IPEC-J2作为TGEV感染特征研究的细胞模型提供了理论依据，为阐明pAPN基因在TGEV入侵宿主细胞的机制及抗病猪新品种的研究奠定了基础。
文章目录
1 材料与方法
1.1 细胞与毒株
1.2 主要试剂
1.3 细胞的培养
1.4 细胞接毒试验
1.5 IPEC-J2-KO的脱靶效应检测
1.6 TGEV病毒基因组RNA拷贝数检测
1.7 蛋白免疫印迹(western blot，WB)检测
1.8 间接免疫荧光分析(indirect immunofluorescence assay，IFA)检测
1.9 50%组织细胞感染量(50% tissue culture infective dose，TCID50)检测
1.10 统计分析
2 结 果
2.1 TGEV感染IPEC-J2-WT最佳时间节点的选择
2.2 IPEC-J2-KO的脱靶检测分析
2.3 IPEC-J2-KO感染特征分析
2.3.1 qPCR检测IPEC-J2-KO中TGEV基因组拷贝数
2.3.2 WB检测IPEC-J2-KO中TGEV-N蛋白表达
2.3.3 IFA检测TGEV-N蛋白表达情况
2.3.4 TCID50检测IPEC-J2-KO的病毒滴度
2.4 TGEV感染对IPEC-J2中转录因子NF-κB活性的影响
3 讨 论
4 结 论
